Sangersekveneerimise

Sangersekveneerimine, tuntud ka kui terminatorsekveneerimine või Maxam-Gilbert meetodi järel, on DNA sekveneerimise meetod, mille töötas välja Frederick Sanger ja tema kolleegid 1970. aastatel. Seda peetakse esimese põlvkonna sekveneerimistehnikaks ja see oli pikka aega kuldstandardiks DNA järjestuse määramisel. Meetod põhineb ddNTP-de (dideoksünukleotiidtrifosfaatide) kasutamisel, mis erinevalt tavalistest dNTP-dest (deoksünukleotiidtrifosfaatidest) ei oma 3' hüdroksüülrühma. Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, peatub ahela elongatsioon, kuna järgmist nukleotiidi ei saa lisada.

Sangersekveneerimise protsess hõlmab DNA amplifitseerimist PCR-i abil, millele järgneb terminatsioonireaktsioon. Selleks kasutatakse nelja erinevat reaktsiooni, millest igaüks sisaldab ühte tüüpi ddNTP-d (ddATP, ddTTP, ddCTP või ddGTP) koos tavaliste dNTP-de, DNA polümeraasi ja primeriga. Tulemuseks on erineva pikkusega DNA fragmentide kogum, mille lõpp-punkt vastab ddNTP tüübile. Seejärel eraldatakse fragmente geel elektroforeesi abil pikkuse järgi. Erineva pikkusega fragmente tuvastatakse fluoresentsmärgistuse abil, kus iga ddNTP on märgistatud erineva värviga. Viimaks loetakse järjestus laseriga, mis tuvastab fluoresentssignaalid ja teisendab need DNA nukleotiidide järjestuseks. Kuigi Sangersekveneerimine on aeglasem ja kallim võrreldes tänapäevaste meetoditega, on see endiselt kasulik väiksemate DNA fragmentide täpseks sekveneerimiseks ja seda kasutatakse laialdaselt geenide kloonimisel, mutatsioonide tuvastamisel ja diagnostikas.