Sangersekveneerimine

Sangeri sekveneerimine on klassikaline DNA-sekveneerimise meetod, mille töötasid välja Frederick Sanger ja kaaslased 1977. aastal. Meetodit kirjeldatakse sageli kui ahela lõpetamise meetodit (chain-termination) ja on pikka aega olnud standardiks väikeste DNA‑alade järjestamiseks.

Põhimõte seisneb selles, et DNA‑polümeraas lisab sünteesitavale templaadile (mallile) uusi nukleotiide ja samaaegselt segus on väga väikeses koguses dideoksinukleotiide (ddNTP-d), mis lõpetavad ahela sünteesi. Iga ddNTP omab kindlat aluspaari (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), ning kui see lisatakse, lõpeb süntees vastavas alusel. Seetõttu tekivad lõplikud fragmendid erineva pikkusega, iga fragmendi lõpp kajastab kindlat baasi.

Fragmendid eralduvad suuruse alusel elektroforeesi teel. Varasemad meetodid kasutasid polüakrülamiid-geele ja radioaktiivset märgistust; tänapäeval kasutatakse kapillaar-elektrofoesi ja fluoroforeeritud märgistusega ddNTP-sid. Sõltuvalt detekteerimise meetodist konstrueeritakse lõplik baasnmerkide järjestus, kasutades konverteerivat tarkvara.

Sangeri sekveneerimine on tuntud oma kõrge täpsuse ja usaldusväärsuse poolest ning lubab lugeda umbes 800–1000 baasi ühel lõigul capillary‑sekveneerimisel. See meetod oli aastakümnete jooksul peamine tööriist plasmidide ja väikeste DNA‑lõikude sekveneerimisel ning on endiselt kasulik valik kontrollimiseks ja väikeste projektide jaoks.

Tänapäeval on suurtöötlemus üha suuremahuliste genoomide jaoks suunatud next-generation sekveneerimise (NGS) tehnoloogiatele; Sangeri meetod jääb siiski kehtivaks vahendiks väikeste projektide, kloonide kinnitamise ja lõinõuete täpsustamiseks.