RTPCRtutkimuksella

RTPCRtutkimuksella tarkoitetaan käänteistranskriptio PCR:n (RT-PCR) käyttöä tutkimusmenetelmänä, jossa RNA muunnetaan ensin käänteistranskriptiossa cDNA:ksi ja tämän jälkeen cDNA monistetaan polymeraasiketjureaktiolla. Menetelmää käytetään sekä RNA:n olemassaolon tunnistamiseen että sen ilmentymän kvantitatiiviseen mittaukseen sekä RNA-virusten havaitsemiseen laboratorioissa.

Käytännössä näyte käsitellään RNA-eristämällä, jonka jälkeen RNA muutetaan cDNA:ksi käänteistranskriptiossa käytettävän entsyymin avulla. Tämän jälkeen cDNA-monistus toteutetaan PCR:llä käyttämällä spesifisiä primer-pareja. Reaaliaikaisessa RT-PCR:ssa (qRT-PCR) ilmentymistä seurataan fluoroforisen signaalin avulla reaaliajassa, ja tulokset esitetään Ct-arvoina tai suhteellisina ilmaisuina.

Sovelluksia ovat muun muassa geenien ilmentymän kvantitatiivinen tutkiminen sekä RNA-pohjaisten patogeenien ja virusten havaitseminen ja kvantifiointi diagnostisissa ja tutkimuksellisissa tarkoituksissa. RT-PCR:tä käytetään myös splice-varianttien ja muiden RNA-tason muutosten analyysissä sekä absoluuttisen tai suhteellisen kvantitoinnin toteuttamisessa.

Laatutekijöitä RTPCRtutkimuksessa ovat RNA:n laatu ja määrä sekä kontaminaation esto. Tärkeät kontrollit ovat no-RT- ja no-template -kontrollit sekä sisäiset normalisointitunnukset (esimerkiksi housekeeping-geenit) ja standardikäyrät, joilla tulokset voidaan muuntaa luotettaviksi kvantitatiivisiksi arvoiksi.

RT-PCR:n kehitys alkoi 1990-luvulla käänteistranskriptioiden ja PCR-tekniikan yhdistämisen myötä, minkä jälkeen menetelmä on muodostunut molecular biologyn ja diagnostiikan keskeiseksi työkaluksi.