cDNAsekvensointia

cDNAsekvensointi on prosessi, jossa RNA-molekyyleistä tuotetaan komplementaarinen DNA (cDNA) ja tämän cDNA:n emäsjärjestys määritetään sekvensoimalla. Koska cDNA heijastaa solun transkriptioita, menetelmä mahdollistaa geenien ilmaisun ja transkriptioiden rakenteen tutkimisen ilman suoraa RNA-analyysiä. cDNAsekvensointi on keskeinen työkalu transcriptomianalyysissä ja uusien transkriptioiden havaitsemisessa.

Prosessi alkaa RNA:n eristämisellä ja sen jälkeen cDNA:n synteesillä reverse transcriptase -entsyymin avulla. Ensimmäisen ja toisen kietojen syntetisoinnin kautta syntyy kaksijuosteinen cDNA. Kirjaston valmistus sisältää adapterien ja usein indeksien liittämisen sekä mahdollisen PCR-kertauksen, jotta näytteet voidaan sekvensioida useassa samanaikaisessa kokeessa.

Teknologiat: Sanger-sekvensointi soveltuu yksittäisten fragmenttien lukemiseen, mutta yleisimmin käytetään lyhytnauhoitteista sekvensointia (NGS), kuten Illumina. Pitkien lukujen teknologiat, kuten PacBio SMRT ja Oxford Nanopore, tuottavat pidempiä luenta-alueita ja voivat lukea kokonaisia cDNA-molekyylejä isoformien erottamiseksi.

Sovellukset: cDNAsekvensointi mahdollistaa transcriptomianalyysin, eli geenien ilmaisun mittaamisen, vaihtoehtoisen silmukoinnin havaitsemisen, uusien transkriptioiden löytämisen sekä alleeli-spesifisen ilmaisun tutkimisen. Lisäksi se tukee isoformien annotointia ja geenivirtojen tutkimista erilaisissa soluryhmissä.

Analyysi ja rajoitteet: sekvensointidatan analysoidaan referenssiin perustuen tai de novo -transkriptomien muodostamiseksi. Ilmaisun tasot normalisoidaan (esim. TPM tai FPKM). Haasteita ovat RNA-laatu, kirjasto- ja PCR-biasit sekä lyhyiden lukujen rajoitukset isoformien erottamisessa.