PCRreaktsioonides

PCRreaktsioonid ehk polümeraasi ahelreaktsioon on molekulaarne meetod konkreetse DNA järjestuse paljundamiseks suurtes kogustes. Reaktsioon eeldab DNA templaati (malli), kahte lühikest DNA primerit, DNA polümeraasi, dNTP-de segu, sobivat bufferit ja magneesium-ione (Mg2+). Tavaliselt kasutatakse termostabilist polümeraasi ning temperatuuri muutmisega toimivat tsüklit, mis võimaldab DNA kopeerimist.

Tsükkel koosneb kolmest faasist: denaturatsioon, annealing ja extension. Denaturatsioonil eralduvad DNA kaks ahelat üksteisest üksikute ahelatena umbes 94–98 °C juures; annealing faasis kinnituvad primerid vastavatele komplementaarsetele järjestustele umbes 50–65 °C juures; extension faasis lisab polümeraas uued nukleotiidid DNA koopiale umbes 72 °C juures. Tsükleid korratakse tavaliselt 25–40 korda, mille käigus DNA hulk kasvab eksponentsiaalselt. Lõpp-produkti suurus sõltub primerite kaugusest mallil.

PCR-il on mitmesuguseid vorme ja rakendusi. Klassikaline PCR paljundab konkreetset piirkonda; kvantitatiivne PCR (qPCR) mõõdab paljundamist reaalajas fluorestseeruvate ühendite või sondide abil; RT-PCR ühendab reverse transcriptioni RNA-st cDNA-ks ning seejärel PCR-i. Rakendused hõlmavad diagnostikat (nt patogeenide tuvastamine), geneetilist kloonimist ja genotüpiseerimist, forensikas ja paleogenoomika. Kvaliteedi kontrollid hõlmavad negatiivset kontrolli (ilma mallita) ja positiivset kontrolli ning kontaminatsiooni ennetamist tööprotsessis.