PCRmenetelmässä

PCR-menettelyssä (polymeraasiketjureaktio) monistetaan tarkoin määritelty DNA-jakso. Menetelmä perustuu toistuvaan lämpötilavaihteluun sekä alukkeiden ja DNA-polymeraasin käyttöön.

Periaate perustuu kolmivaiheiseen sykliin: denaturaatio avaa kaksijuosteisen DNA:n, annealing-vaiheessa alukkeet kiinnittyvät kohdesekvenssiin, ja laajennusvaiheessa DNA-polymeraasi rakentaa uutta ketjua. Jokainen sykli vahvistaa kopioitua materiaalia ja pitkän aikavälin syklistä voidaan toistaa useita kymmeniä tai satoja kertoja.

PCR-reaktio koostuu DNA-matriisista, kahdesta alukkeesta (etenevä ja vastin), thermostable DNA-polymeraasista, dNTP-yhdisteistä sekä puskurista ja Mg2+-ioneista. Reaktio käynnistetään ja toistuvat sykli suoritetaan PCR-laitteessa (thermocycler).

Erikoisversioita ovat qPCR (real-time PCR), joka mittaa amplifioitua tuotetta reaaliajassa fluoresenssin avulla, sekä RT-PCR (reverse transcription PCR), joka aloittaa RNA:sta käänteiskopioimalla sen DNA:ksi ennen PCR:ää. Multiplex-PCR käyttää useita alukkeita useampia kohteita samassa reaktiossa.

PCR:ää hyödynnetään patogeenien havaitsemisessa, geenien ilmentymän tutkimuksessa, kloonauksessa, sekvensoinnissa sekä oikeuslääketieteessä. Menetelmän etuja ovat herkkyys, nopeus ja kyky työskennellä pienillä näytteillä; rajoitteita ovat alukkeiden suunnittelun haasteet sekä kontaminaation ja näytteenioneiden inhibitors, jotka voivat johtaa virheellisiin tuloksiin.

PCR:n kehitti Kary Mullis vuonna 1983, ja hän sai siitä Nobelin palkinnon vuonna 1993.