IsoformQuantifizierung

Isoformquantifizierung bezeichnet die Schätzung der Abundanzen einzelner Transkript-Isoformen, die durch alternatives Spleißen, alternative Promoter oder alternative Termination entstehen. Ziel ist es, die Expression jedes Isoforms separat zu bestimmen, nicht nur die Gesamtexpression des entsprechenden Gens.

In der Praxis basiert Isoformquantifizierung meist auf RNA-Sequencing-Daten. Zwei Hauptansätze existieren: alignment-based und alignment-free (oder pseudoalignment). Bei alignment-basierten Verfahren werden Reads auf ein Referenz-Transkriptom oder -Genom ausgerichtet (z. B. mit STAR oder HISAT2) und anschließend mit Methoden wie RSEM, StringTie oder Cufflinks die Isoformabundanzen schätzend bestimmt. Alignment-free Tools wie Kallisto oder Salmon verwenden Pseudoalignment bzw. schnelle Abtastung, um Transkriptabundanzen direkt zu schätzen. Die Ausgaben umfassen typischerweise Transcripts per Million (TPM) oder Fragments per Kilobase pro Million (FPKM/RPKM) sowie Rohzählungen, die sich für Differential Isoform Usage-Analysen verwenden lassen.

Herausforderungen ergeben sich durch die Ähnlichkeit zahlreicher Isoformen, unvollständige oder fehlerhafte Annotationen, unterschiedliche UTR-Längen und Sequenzbias. Mehrfachzuordnungen von Reads an mehrere Isoformen vermindern die Identifizierbarkeit, wodurch unsichere Zuweisungen entstehen. Eine sinnvolle Normalisierung über Proben hinweg (z. B. TPM) ist erforderlich, um Vergleiche zu ermöglichen. Langstückensequenzierung (z. B. PacBio Iso-Seq, Nanopore) verbessert die Isoformidentifikation, bleibt aber fehleranfällig und ressourcenintensiv.

Anwendungen umfassen die Analyse alternativer Spleißmuster, differential Isoform Usage, Biomarkerfindung und das Verständnis der Transcriptom-Komplexität in Gesundheit und Krankheit.