Epifluoresenssi

Epifluoresenssi, tai epifluoresenssimikroskopia, on fluoresenssimikroskopian perusmenetelmä, jossa näyte valaistaan epifluoressenssiin tarkoitettujen valo-olosuhteiden kautta eli valo johdetaan näytteen päälle objektivin kautta. Epifluoresenssi tarkoittaa, että sekä valonlähde että havaintokanava käyttävät samaa objektiivia, ja valon suunnasta puhutaan epiasemaan antavan nimeä.

Periaate perustuu suodattimiin ja kaksoispeilipäällykseen: valo kulkee lähteestä excitation-suodattimen kautta, heijastuu kaksoispeilillä (dichroic mirror) kohti näytettä, joka emittoi fluoresenssia. Emissio kulkee takaisin objektiivin läpi ja ohjautuu suodattimen kautta havaitsimelle (kamera tai detectori). Yleensä käytetään lisäksi suodinsarjaa (emissio- ja eksisaatiovärit) sekä haluttua väriframausta.

Sovellukset ja käyttökohteet kattavat laajan biologian ja biomedisiinin kentän: immunofluoresenssiä, immunohistokemiaa, in situ-hybridisaatiota (FISH), sekä entsyymi- tai geenilabeloituja molekyylejä. Epifluoresenssi soveltuu sekä kiinteäksi fikseerattuihin että elävien solujen näytteisiin, erityisesti kun käytetään fluoroforeja kuten fluoresceiinia, rhodamiinia tai GFP:tä.

Hyödyt ja rajoitukset: epifluoresenssi tarjoaa korkean herkkyyden ja nopean kuvauksen, mutta saattaa tuottaa epäselvyyttä syvästä osiosta johtuvan epifluoresenssien valon vuoksi (taustavalo, häviö). Tämä rajoittaa z-täsmäyttä- ja optisen resoluution vertaillen konfo- tai strukturointi-tekniikoihin; fotoblahi ja näytteen fotopoltto voivat olla huomioon otettavia tekijöitä. Modernit järjestelmät täydentyvät LED- tai lampulähteillä sekä nykyaikaisilla kameroilla ja automaattisilla suodinsarjoilla.

---