Ketjunpysäytyssekvensointi

Ketjunpysäytyssekvensointi, joka tunnetaan myös nimellä Sanger-sekvensointi, on menetelmä DNA-sekvenssin määrittämiseksi. Se perustuu synteettisten dideoksinukleotidien käyttöön, jotka keskeyttävät DNA-replikaation. Kun DNA-sekvensointi suoritetaan, käytetään neljää erilaista reaktiota, joista jokainen sisältää yhden dideoksinukleotidin (dATP, dCTP, dGTP tai dTTP) ja normaalit deoksinukleotidit. Dideoksinukleotidit ovat merkittyjä fluoresoivilla väriaineilla, jotka ovat yksilöllisiä kullekin nukleotidille.

Kun DNA-polymeraasi replikoi DNA-templatea, se liittää deoksinukleotideja ketjuun. Kuitenkin, jos se kohtaa dideoksinukleotidin, replikaatio pysähtyy, koska dideoksinukleotidista puuttuu 3'-hydroksyyliryhmä, joka tarvitaan seuraavan nukleotidin liittämiseen. Tämä johtaa erikokoisten DNA-fragmenttien joukkoon, jotka kaikki päättyvät tiettyyn dideoksinukleotidiin. Koska dideoksinukleotidit ovat leimattuja eri väreillä, fragmentit voidaan erottaa koon mukaan käyttämällä kapillaarielektroforeesia ja tunnistaa niiden päätenukleotidi fluoresenssisignaalin perusteella.

Näiden fragmenttien järjestys tunnistetaan sitten lukemalla värit sekvensserin ohjelmistolla. Tulos on DNA-sekvenssi, joka edustaa alkuperäistä DNA-mallia. Ketjunpysäytyssekvensointi oli pitkään kultainen standardi DNA-sekvensoinnille ja sitä käytetään edelleen laajalti pienempien DNA-näytteiden sekvensointiin, geenien tunnistukseen ja genotyyppien määrittämiseen. Sen tarkkuus ja luotettavuus tekevät siitä arvokkaan työkalun geneettisessä tutkimuksessa ja diagnostiikassa.